活体动物光学成像系统在活体荧光成像中的应用

第一部分 技术原理
一、  技术简介
随着活体动物光学成像技术在国内外的普及和应用，越来越多的科研人员希望能通过该技术来观察活体动物体内肿瘤细胞的生长以及对药物治疗的反应，希望能观察到荧光标记的多肽、抗体、小分子药物在体内的分布和代谢情况。NightOWL ⅡLB 983NC320活体动物光学成像系统正是为满足这样的应用需求而设计的。该系统通过荧光光路的特殊设计，实现了对激发光的能量控制和调节，提高了活体荧光成像的稳定性和灵敏度，并且该系统操作简单、费用低廉、不涉及放射性，是不错的进行活体荧光成像的仪器。与传统技术相比，活体荧光成像技术不需要杀死动物，可以对同一个动物进行长时间反复跟踪成像，既可以提高数据的可比性，避免个体差异对试验结果的影响。更重要的是，该技术可以得到直观的成像图片，了解标记物在动物体内的分布和代谢情况，避免了传统的体外实验方法的诸多缺点，特别是在药物制剂学、药物临床前研究中有不可估量的应用前景。

NightOWLⅡLB 983NC320活体荧光体内成像技术的基本原理是激发光源通过特殊的光路设计使其能量稳定、强度合适的激发光使荧光基团达到较高的能量水平，然后发射出较长波长的散射光，该散射光可以穿透实验动物的组织并且可由仪器cooling slow scaningCCD以光子数量化检测到光强度，同时反应出标记物的数量。

二、  标记原理
活体荧光成像技术有三种标记方法：荧光蛋白标记、荧光染料标记和量子点标记。荧光蛋白适用于标记肿瘤细胞、病毒、基因等。通常使用的是GFP、EGFP、RFP（DsRed）等。荧光染料标记和体外标记方法相同，常用的有Cy3、Cy5、Cy5.5及Cy7，可以标记抗体、多肽、小分子药物等。量子点标记作为一种新的标记方法，是有机荧光染料的发射光强的20倍，稳定性强100倍以上，具有荧光发光光谱较窄、量子产率高、不易漂白、激发光谱宽、颜色可调，并且光化学稳定性高，不易分解等诸多优点。量子点是一种能发射荧光的半导体纳米微晶体，尺寸在100nm以下，外观恰似一极小的点状物。它可以经受反复多次激发，而不像有机荧光染料那样容易发生荧光淬灭。已经证实了量子点的成像深度远远超过标准的荧光素如果能与抗体结合配对，就可以作为跟踪组织细胞的探针，或者探测低浓度的抗体。如果能解决不同材料的量子点偶联、功能化标记问题，就可以用量子点代替很多荧光染料分子。

 

三、  技术特性
在活体动物光学成像技术中，相对于生物发光成像技术，荧光成像技术的优势主要表现在：
1.  荧光染料、蛋白标记能力强
荧光标记物种类繁多，包括荧光蛋白、荧光分子、量子点等，可以与基因、多肽、抗体等生物分子标记，作为分子探针使用范围广。同时不同的荧光蛋白或染料还可对样本进行多重标记，同时成像。检测的波长范围从300nm到1100nm，我们可以提供全光谱的滤光片实现几乎所有荧光标记的体内成像。
2.  信号强度大
由于荧光是在外界光源激发下产生的能量转移现象，其光子强度较其它光学信号更强，持续时间长，信号所反应的样本信息量更丰富，对信号接收仪器的要求相对较低，节省更多的实验成本。
3.  实验成本低
相对于活体生物发光成像来说，费用低廉，不需要底物。荧光发光基团只要在其合适强度的激发光激发下就可以发出定波长的发射光信号，整个反映不需要添加任何昂贵的反应成分，只要保证荧光基团稳定，就可实现随时激发随时发光的效果。
4.  活体、尸体、器官全部可以进行成像
由于荧光是基于物理能量转移原理，对实验样本的生理状态要求较低，可以实现活体、尸体、尸解组织器官样本的光学成像。
5.  操作简便，测量快速，每次检测时间仅为毫秒级，同时可检测多个动物
6.  分辨率提高，可达到2-3mm（生物发光的分辨率在3-5mm）

但是，任何技术都是优点和缺点并存，荧光成像技术常出现的问题主要有：
1.  自发荧光
实验样本尤其是小动物会产生自发荧光，主要是来源于皮毛和血液的自发荧光。对于皮毛中的黑色素是皮毛中主要的自发荧光源，其发光光线波长峰值在500-520nm左右，在一般的绿色荧光作为探针时，影响最为严重。另外，食物中的叶绿素、动物血液都会产生较强的非特异性自发荧光。但生物体内很多物质在受到激发光激发后，也会发出荧光，产生的非特异性荧光会影响到检测灵敏度。特别是当发光细胞深藏于组织内部，则需要较高能量的激发光源，也就会产生很强的背景噪音。
2.  光被动物组织吸收特性
在小动物实验时，光在动物组织内传播时会被吸收，而且不同类型的细胞和组织吸收光子的特性并不一样，血红蛋白（hemoglobin），黑色素是造成体内可见光被吸收的主要因素，其吸收可见光中蓝绿光波段的大部分。但是在可见光大于600纳米的红光、近红外波段，血红蛋白的吸收作用却很小，在偏红光区域，大量的光可以穿过组织和皮肤而被检测到。由此可见，红光的穿透性在体内比蓝绿光的穿透性要好得多，因此逐渐成为活体荧光成像实验的热点，活体荧光实验建议选择发射较长波长的标记物，近红外荧光已经成为活体成像标记的重要选择。
3.  背景光干扰
在一般epi顶部荧光激发/检测类装置中，激发背景光的干扰也是荧光检测手段的一个问题，目前很多技术类革新都在试图降低背景光的干扰，比如利用侧面激发/顶部接收装置、底部透射激发装置等改变常规成像仪器的光路设计，达到降低背景光的目的。现有技术采用不同的原理，尽量降低背景信号，获取机体中荧光的准确信息。目前以NightOWL ⅡLB983 NC 320为活体动物可见光成像系统为荧光成像的主要代表。

 

第二部分 仪器原理

以Berthold公司的NightOWL ⅡLB 983 NC320活体动物光学成像系统所示，体内可见光成像系统主要由四部分组成：　

一、  CCD
选择适当的CCD镜头，对于体内可见光成像是非常重要的。更为合适的CCD是制冷型的前照射CCD。选用的CCD镜头对于波长600nm左右的光必须具有非常高的灵敏度和量子效率，而且由于需要探测的光源在皮下几厘米处，其噪声信号要尽可能的小。NightOWL ⅡLB 983 NC320活体光学成像系统提供更为合适于荧光检测的CCD是制冷型的前照射CCD，NC 320。NightOWL ⅡLB 983NC320活体动物可见光成像系统采用的CCD像素大小达到6.8µm，像素达到400万，分辨率可达到5µm。

综上所述，荧光成像对CCD相机选择的要求是：
  CCD 类型：单光子计数冷CCD，光子计数类CCD可以进行荧光量化分析。
  CCD像素分辨率：由于荧光背景光较强，产生非特异性杂光干扰明显，需要配有高分辨率CCD的相机。
  CCD 光谱覆盖能力：全波长覆盖。

荧光对其它常见参数的要求：
  CCD量子效率（QE）：荧光反应光子能量强，CCD容易捕捉到光子信号，CCD 不需要对QE有过高的要求。
  CCD感光类别（前部感光/背部感光）：背部感光CCD芯片只有在检测极弱光信号优势明显，但在强光检测中与前部感光CCD芯片无差别，但其成本较高的弱势使其不属于荧光检测常规要素。
  CCD读数噪音：在强光检测中，CCD 的噪音影响比起荧光背景光的影响微乎其微， 只有在发光检测时才会显出明显优势。
  CCD暗电流：荧光检测不需要对CCD暗电流有太多要求。

二、  成像暗箱
成像暗箱采用德国工艺、精钢锻造，内附高级光学避光涂层，可屏蔽宇宙射线及一切光源，可以使暗箱内部保持完全黑暗，CCD所检测的光线完全由被检动物体内发出，避免外界环境的非特异光污染。CCD镜头位于暗箱的顶部，光线通过光圈被CCD收集。暗箱里的CCD相机是由软件控制升降，升降精度可以达到0.01mm，相机高度与信号收集经过线性校对，通过升降可以获得宽视野拍照能力，拍照视野（FOV）从3.5厘米到26厘米，最多可同时检测五只小鼠，并且带有加热装置，可以保持观察实验动物的体温。

三、  荧光激发和接收系统
在活体荧光检测中经常碰到的问题是荧光反射光造成的背景很强，影响信号的检测。因此在活体荧光检测中对于激发光能量的控制就显得非常重要，当检测样本小，或检测区域小，适于用低能量的激发光，当样本个体较大，或检测位置较深，则高能量的激发光更适合，或同时配合gooseneck鹅颈管激发装置使用，效果更佳。同时，一般的荧光光源的能量会随着时间和波长的变化而变化，这对定量研究的体内实验是极其不利的。在这样的应用需求下，NightOWL ⅡLB 983 NC320活体动物可见光成像系统率先采用了荧光光源能量反馈控制系统，并且通过该系统调节激发光的能量在检测时间内的稳定控制，对于每一次荧光检测都可保证持续稳定的激发光，整个激发光路能量始终统一、稳定，激发光能量直接关系到发射光信号强弱，需要确保在整个长时间多次成像中输出稳定的激发光，达到检测时间内的稳定控制，特别是在多编组样本分析时。仪器本身可以通过此系统控制激发光的能量，0%~100%可调节，针对不同的样本使用不同强度的激发光，这就大大提高了活体荧光成像的灵敏度和稳定性，增加了活体荧光成像技术的应用范围，使仪器成为开放性的检测平台。
在荧光单元，配备典型的荧光激发/接收装置，从顶部激发样本发光，当相机对样本进行调焦定位时，会同时检测到发射光信号，接收信号强度直接与相机的调焦高度相关，方便获取最佳观测值。整个装置需要配合选择合适的光源和滤光片来激发荧光团，检测样本的发射光。NightOWL ⅡLB 983NC320还配有光能在线反馈控制装置，使整个激发光路能量始终统一、稳定，对于每一次荧光检测都可保证持续稳定的激发光。仪器对于在不同时间发出的同一波长的光线，或者不同波长的光线，光能稳定对于定量研究非常重要，激发光能量直接关系到发射光信号强弱，特别是在多编组样本分析时，需要确保在整个长时间多次成像中输出稳定的激发光。而光源本身能量不是恒定不变的，为此我们的光路配有能量在线反馈控制装置，实时监控光路，反馈补偿光源能量变动导致的激发能量突增或缺失，以确保整个激发单元的能量始终统一。光源的光效稳定性有利于定量观察。

为了荧光光源发出的激发光能稳定均匀地照射在待测样本上，同时为了检测微小样本或者进行深度检测，NightOWL ⅡLB 983NC320活体动物可见光成像系统设计了一系列激发光组件实现上述目的。环状照射装置，激发高度可调，其特点是输出光线均匀统一，使照射在样品上的激发能量始终保持统一。鹅颈管照射装置，可以得到spot聚光，针对老鼠等试验动物局部（头部、四肢、某一内脏部等）或小体型物种（蚕、果蝇等）。鱼尾型照射装置的特点是聚光激发，高能量激发光可以提高穿透样本皮层深度，增强发射光的强度，适合激发弱信号（由于浓度低或皮下深度原因）。上述激发装置采用多模块即插即用式设计，使应用更具针对性及广泛性，操作简便。

另外操作软件可以直接控制激发光源的照射能量，它有利于成像系统根据每一种荧光物质、或实验样本种类及其部位作针对性的调节，在同一样本中对不同荧光团的数量比较就会很容易实现。软件控制的滤光片支架提供在一个测读次序中激发光和发射光滤光片的快速转换，特别对比率制检测读数的应用是非常重要的。操作软件中灵活的检测方案设定功能可完成在同一时间内对不同波长发射光的检测，发射光滤光片之间的转换时间小于500ms，远快于相机的测读时间。高光阻宽透射率滤光片被安装在仪器最佳的位置，如果客户需要，可以很方便的更换其它种类的滤光片，Berthold提供全波长滤光片组，多达几百中滤光片可供选择。通常，我们选择经常使用的6种荧光检测配置对应的滤光片，如下所示：

GFP:    Ex475/20 (53183)    Em520/10 (39805)
dsRed/RFP:  Ex530/20 (38536)    Em600/20 (50477)
Cy5:    Ex630/20 (50097)    Em680/30 (49180)
Cy5.5:    Ex630/20 (50097)    Em700/20 (50479)
Cy7:    Ex700/20 (50475)    Em780/20 (50476)
ICG    Ex740/30 (50480)    Em820/30 (50481)
(Cardiogreen):

为了进一步提高灵敏度，也可以配置先进的荧光透射仪，用于从样本底部激发样本。激发光波长为625nm，强度可调。透射区域大小为20cm*20cm。

四、  软件系统
软件系统负责仪器控制和图像分析。软件控制镜头的焦距，曝光时间，滤光镜的更换，照明灯的开启，相机的升降，操作简便。典型的成像过程是：小鼠被麻醉后放入成像暗箱平台，软件控制相机的升降到一个合适的视野，自动开启照明灯拍摄第一次背景图。下一步，自动关闭照明灯,在没有外界光源的条件下拍摄由小鼠体内发出的光，即为活体荧光成像。与第一次的背景图叠加后可以清楚的显示动物体内光源的位置，完成成像操作。之后，软件完成图像分析过程。使用者可以方便的选取感兴趣的区域进行测量和数据处理及保存工作。当选定需要测量的区域后，软件可以计算出此区域发出的光子数，获得实验数据。软件的数据处理和保存功能非常强大，可以加快实验速度，方便大批量的实验。

原始数据与处理后数据分开存档（根据GLP规则）
多种图像单位方式，以counts或Photon计数均可
可以进行图像输入及输出（由Winlight生成的TIF文件可很容易的被其它软件包分析处理，例如Image Pro, Media Cybernetics）从而实现与PET图像的兼容。
去宇宙射线功能，将宇宙射线造成的干扰均化处理
三维成像分析
多孔板计算功能
几何学图像分析，可计算选定区域的光强度
色彩叠加功能，例如带有生物发光图像的影像合成；带有杂交信号的荧光凝胶成像；或其它类型的荧光成像
量化分析
分析结果以电子表格形式输出
图像处理功能强大，带有图像对比、图像增强工具。
放大功能
插入部分的界定及测算功能

第三部分 应用领域

通过NightOWL ⅡLB 983活体动物光学成像系统，可以观测到肿瘤细胞的发展进程以及药物治疗所产生的反应，并可用于分子探针、药物制剂学、临床前研究等领域。

一、  荧光蛋白标记的应用
肿瘤学应用
NightOWLⅡLB 983NC320活体动物光学成像系统能够让研究人员能够直接快速的测量各种癌症模型中肿瘤的生长。活体荧光成像技术能够无创伤定量检验小鼠整体的原位瘤、皮下瘤等。活体荧光成像技术提高了检测的敏锐度，可对癌症治疗中癌细胞的变化进行实时观测和评估。

荧光蛋白癌症模型可应用于癌症体内用药的疗法中。利用无创伤活体荧光成像对癌细胞生长的检测，可对癌症治疗之前和过程中的癌细胞的变化进行实时观测和评估。这种方式提供一个很好的对癌细胞的反应和复发评估的预诊断途径。该设备可置于药物保护区域内，用于药物的常规检测。而且，成像分析软件更有精确定量的特性，使数据分析更容易。定量检测整体老鼠肿瘤，利用无创伤检测手段长期跟踪观察治疗方法。

二、  荧光染料标记的应用
1.  分子探针
分子探针的一端联有能够和生物体内特异靶点结合的分子结构（如肽类、酶的底物、配体等），另一端则是荧光染料。有科研人员应用Cy5.5标记的抗体的体内代谢实验，可见肝、肾等处的分布。这是分子探针应用NightOWL ⅡLB 983NC320活体动物光学成像系系统的先例。荧光探针本身也需要进一步改进与提高，需要改进探针的通透性，提高活性和特异性，降低毒性和副作用等。目前这些改进都有专门的公司和机构在研究中。

2.  药物治疗效果
应用透射仪从样本底部激发光源，可以提高活体荧光成像的灵敏度和检测的深度。

3.  药物靶向研究
有关专家正在设计用合适的荧光染料标记小分子药物，观察药物在动物体内的特异性分布和代谢情况。尤其是中药研究方面，如果这样的设想能够实现，将是中药研究的重大进展。复旦大学的科研人员研究荧光标记的药物在体内的分布规律，可见胃、肝以及膀胱等处的分布。

三、  量子点标记的应用
1.  量子点标记肿瘤细胞
通过量子点可以标记肿瘤细胞，有科研人员用量子点Qtracker® 705对MDA-MB-231乳腺癌细胞进行标记，皮下接种后动态观察其生长以及变化。激发光波长625nm ，散射光波长680nm。

2.  量子点标记肿瘤在小鼠的成像
利用活体成像技术观察荧光量子点在裸鼠体内聚集在淋巴结处的发射光强度，从而判断量子点在动物体内定向转移及聚集效果，确定体内所处的具体位置。红色量子点荧光染料在外激发光波长630nm刺激下产生700nm左右的发射光，通过冷CCD相机来捕捉其发出的光子图像。注射部位：右侧前爪皮下注射；量子点聚集区域：腋下淋巴结。利用鹅颈管作为激发光源，光能40% 。

3.  量子点标记肿瘤在家兔的成像
利用活体成像技术观察荧光量子点在兔子体内聚集在淋巴结处的发射光强度，从而判断量子点在动物体内定向转移及聚集效果，确定体内所处的具体位置。红色量子点荧光染料在外激发光波长630nm刺激下产生700nm左右的发射光，通过冷CCD相机来捕捉其发出的光子图像。样本注射位置：右胸乳腺；量子点聚集区域：腋下淋巴处；利用鹅颈管作为激发光源，光能80%。采用新西兰大白兔，兔子左侧胸部，局部脱毛。

4.  其他
在文献记载中，量子点可以标记肿瘤细胞，观察肿瘤细胞在动物体内的走向和变化。目前正在尝试和探索量子点是否可以标记中药单体，标记抗体、多肽等进行成像。